Cell | 惊！首次鉴定原核生物中普遍存在ECNs，窥探细菌神秘的电子传递方式

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在无氧环境中，从水生沉积物到人类肠道，呼吸细菌自然地将距其外膜微米级的电子转移到遥远且不溶的终端电子受体上。据推测，在地球早期，长距离电子传递在微生物新陈代谢中发挥了重要作用，当时铁作为Fe(II)是最易得到的过渡金属，Fe(III)则是潜在的电子受体，因为低氧水平下存在少量的Fe(III)。Fe(III)可能以赤铁矿或磁铁矿的形式存在¹，因此需要存在细胞外纳米线，以便不同的Fe(III)化合物可以被用作终端电子受体。细菌纳米线使直接种间电子传递 (DIET) 成为可能，在不同厌氧微生物群落中为不同物种之间的能量耦合铺平了道路²。例如，最近的报道表明，纳米线介导的DIET在某些厌氧消化器中普遍存在，并可提供电子用于将CO₂还原为CH₄。此外，据报道，微生物纳米线介导的DIET也有助于一些重要的环境过程，如与硫酸盐还原偶联的厌氧甲烷氧化，厌氧光合作用和厌氧暗合成碳。然而，长距离电子传递的分子基础仅在土壤细菌Geobacter sulfurreducens中得到了确定³。

图 1 通过DIET培养的细菌共培养物中形成的细菌纳米线²

G. sulfurreducens是一个广泛研究的模式生物，用于了解导电细胞外纳米线的结构和功能。形成细胞外电子传递 (ETT) 的传导丝附属物一直备受关注，随着冷冻电镜的重大技术进步，在G. sulfurreducens中的微生物纳米线已被证明是聚合的细胞外色素丝（extracellular cytochrome nanowires, ECNs)，包含OmcS，OmcE或OmcZ。

多卟啉C型色素OmcS、OmcE和OmcZ的蛋白结构约80%为环，缺乏广泛的二级结构和保守的结构折叠。在原核生物基因组中发现了大量的多卟啉色素，并观察到卟啉排列的显著差异，因此很可能传导ECNs在进化过程中已经多次发生，有人提出除Geobacter sulfurreducens之外的物种也可以产生ECNs。虽然预测由甲烷氧化古菌编码的多卟啉色素会介导DIET，但迄今为止并没有呈现出G. sulfurreducens以外存在ECNs的证据。

2023年6月7日，美国弗吉尼亚大学Fengbin Wang实验室与巴黎城市大学Mart Krupovic实验室合作，在Cell期刊上发表了题为Extracellular cytochrome nanowires appear to be ubiquitous in prokaryotes的论文。研究者验证了ECNs不仅限于G. sulfurreducens的假设，基于Cryo-EM技术，研究者确定了两个不同门的两种超热古菌，Pyrobaculum calidifontis和Archaeoglobus veneficus的细胞外色素丝的原子结构。观察表明，ECNs可能在两个原核域中普遍存在，并在不同的微生物群落中介导长距离EET。

在古菌中，预测到真古菌门和高温古菌门具有多重血红素C型细胞色素基因。为了确定预测的多重血红素C型细胞色素蛋白中潜在的ECN，研究者基于这些ECN特征进行筛选：蛋白质必须具有预测的信号肽，缺乏预测的跨膜区域（信号肽外部），在同一菌株中与其他多重血红素C型细胞色素编码，并缺乏已注释的酶折叠序列同源性。最后选择了三个ECN候选者进行验证，它们分别来自P.calidifontis（高温古菌门）、A. veneficus（真古菌门）和Methanolobus tindarius。分析表明，P. calidifontis ECN（PcECN）与先前确定的蛋白质折叠没有明显的相似性；A. veneficus ECN（AvECN）虽然与C552家族细胞色素遥远相关，但也呈现出新的蛋白质折叠。

随后，研究者成功解析了PcECN的冷冻电镜结构，分辨率为3.8Å。与Geobacter OmcS丝不同，PcECN不显示出正弦形态（图2A）。A3MW92被唯一地确定为P. calidifontis的ECN蛋白质。该结构模型从预测蛋白质的第24个位置开始，表明A3MW92在N端被加工，与此观察一致，A3MW92具有强烈的信号肽（p=0.97）。这些结果表明，PcECN使用Sec分泌系统分泌到胞外。

图 2 P. calidifontis ECN的冷冻电镜结构

有趣的是，与G. sulfurreducens ECNs相比，PcECN模型具有相当高的二级结构含量（图2C）。随之，研究者提出，PcECN是否具有类似于其他已知蛋白质结构的结构折叠。然而，尚未识别出具有类似折叠的已知实验确定的结构。尽管如此，PcECN模型中的血红素排列与G. sulfurreducens OmcS和OmcE纤维的非常相似。PcECN中相邻的血红素卟啉环采用面对面的反平行或T形构象，并且这些构象在纤维上交替发生（图2C和2D）。此外，卟啉环之间的边到边距离与OmcS和OmcE相当，范围为4.2 ~ 6.4 Å（图2D），表明存在类似的电子转移机制。

接下来，研究者成功解析了AvECN的冷冻电镜结构，显示出强烈的正弦形态，分辨率为4.1Å。通过追踪蛋白质链，显然每个AvECN亚单位也包含四个血红素分子（图3B-3E），与PcECN发现的情况类似。F2KMU8被鉴定为A.veneficus中的AvECN蛋白质，类似于PcECN，AvECN具有预测的N末端信号肽，因此也可能通过Sec分泌系统跨膜运输。

图 3 A. veneficus ECN的冷冻电镜结构

相比PcECN，AvECN具有更高的二级结构含量（图3C），但同样未能识别到相似的蛋白质折叠，AvECN的折叠形态与PcECN的折叠形态也无关（图2C）。在ECN亚单位内，四个血红素分子被一些分布疏松的α螺旋包围。同时，C末端区域（残基190-250）形成了一种从亚单位主体中伸出的扩展“臂状”结构，由多个反平行β链组成（图3C）。

研究表明，在能够高效电子转移的蛋白质中存在着优选的血红素-血红素配对基序。具体来说，观察到了两个主要的簇：反平行血红素配对和“T形”血红素配对（图4A）。在AvECN和PcECN中，所有的卟啉对都属于这两个簇，并且这两种血红素堆叠总是交替出现，即反平行→ T形→反平行→ T形。这一观察结果也适用于G. sulfurreducens的OmcS和OmcE丝状体（图4A）。

图 4 ECN中血红素的保守堆积

然后研究者提出是否ECN已经演化出一种优化的血红素堆积方式，沿着丝状体进行长距离电子转移。通过比较AvECN、PcECN、OmcS、OmcE和OmcZ中所有可能的四个血红素排列，前两个血红素是反平行对。引人瞩目的是，除了OmcZ的排列外，所有这些排列都非常相似（图4B）。这些结果表明，当ECN包裹着一个溶剂无法接近的电子传输通路时，存在一种优化的血红素叠层模式，交替出现反平行和T形排列。相反，对于包含溶剂可接近的血红素（OmcZ）的ECN，存在不同的血红素模式。

据推测，不同蛋白质家族中的血红素堆积方式相似。因为四个血红素阵列在完全隔离的ECNs中是一致的，所以研究者提出这种四个血红素阵列是否可以在传递更短距离的其他蛋白质家族中找到。因此，他们分析了PDB中的所有多血红素，确定了所有与ECNs中看到的相似的四个血红素阵列。惊奇地发现，这种四个血红素阵列模式在自然界中是普遍存在的（图5），表明这是一种    进化优化的血红素取向，可用于高效传递电子。

图 5 相似的血红素排列存在于不同的蛋白质家族中

研究者接下来研究了P. calidifontis和A. veneficus中包含ECN编码基因的基因组位点。特别是对于P. calidifontis，ECN基因散布在呼吸硝还原酶和细胞色素C生成系统 (Ccm) 的表观操纵子之间（图6A）。硝酸盐还原酶是一种多组分膜蛋白复合物，负责将亚硝酸还原成氨。相反，Ccm系统负责跨膜传输血红素及其共价连接到无血红素细胞色素C。因此，根据其基因组邻近性，PcECN可能参与硝酸盐还原，并且其成熟取决于Ccm机制。与PcECN相比，AvECN基因的基因组环境信息较少（图6A）。为了探索这两个古菌ECN同源基因的系统分布，研究者对非冗余GenBank蛋白质序列数据库进行了PSI-BLAST搜索。虽然在古菌Desulfurococcales之外没有检测到PcECN的同源物，但是AvECN分布更广（图6B）。

图 6 古细菌ECN同源物的多样性和分布

总的来说，研究者通过生信分析在古菌中鉴定了三种菌株存在潜在的细胞外细胞色素丝，并在这些古菌中的两株（P. calidifontis和A. veneficus）中发现了ECNs并确定了它们的原子结构。虽然不同的ECN中不存在折叠相似性，但血红素的堆积呈现出保守性。此外，研究者还通过探索这两个古菌ECN同源基因的分布，强烈表明这种ECNs在依靠长距离电子传递进行代谢的细菌和古菌中是普遍存在的。这项研究的局限性之一在于缺乏对古菌胞外细胞色素丝的电导率测量。在未来的研究中，研究者将对细菌和古菌进一步研究以揭示更多ECN的存在和结构，这项研究也为纳米线在生物医学器械、纳米电子和生物能源等领域的巨大潜力提供了理论依据。

原文链接

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)00531-7#secsectitle0020

参考文献

参考文献

[1] Vargas M. Kashefi K. Blunt-Harris E.L. Lovley D.R. Microbiological evidence for Fe(III) reduction on early Earth. Nature. 1998; 395: 65-67

[2] Lovley D.R. Syntrophy goes electric: direct interspecies electron transfer. Annu. Rev. Microbiol. 2017; 71: 643-664

[3] Wang F. Craig L. Liu X. Rensing C. Egelman E.H. Microbial nanowires: type IV pili or cytochrome filaments. Trends Microbiol. 2023; 31: 384-392

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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